PCR Test en Diagnostiek

Clinical Microbiology and Infection: 1 – 7, 2020
Rania Francis, Marion Le Bideau, Priscilla Jardot, Clio Grimaldier, Didier Raoult, Jacques Yaacoub Bou Khalil, Bernard La Scola
High-speed large-scale automated isolation of SARS-CoV-2 from clinical samples using miniaturized co-culture coupled to high content screening

Only a few laboratories routinely isolate the virus, which is because the current co-culture strategy is highly time-consuming and requires a biosafety level 3 laboratory. This work aimed to develop a new high-throughput isolation strategy using novel technologies for rapid and automated isolation of SARS-CoV-2.

Mail aan Diederik Gommers

Prof.dr. Diederik Gommers stuurde een bericht aan biochemicus drs. Mario Ortiz via LinkedIn. In dat bericht gaf hij aan, het eens te zijn met hem, dat de PCR test, waarmee het SARS-COV-2 virus wordt getest bij mensen, niets zegt over de klinische implicaties en het eventuele ziekteverloop. Sterker nog, volgens biochemicus Ortiz, is het veelal een klein stukje schroot en een – niet actief en in minuscule kleine getalen aanwezig – dood virusdeeltje (een virus is niet levend, zoals een bacterie of schimmel).
Programmamaker, Flavio Pasquino interviewde deskundige Ortiz, over de waarde en betekenis van de PRC test methode en de rampzalige gevolgen ervan. Ze spraken over het bericht van prof. dr. Diederik Gommers en de ontwijkende antwoorden van prof. dr. Jaap van Dissel tijdens de technische briefing. Tevens analyseerden ze de technische briefing van de NOS op 11 aug 2020, waar kamerleden vragen konden stellen aan het RIVM en de GGD. In de video refereert Flavio Pasquino naar een brief die Ortiz heeft verzonden aan alle kamerleden. De brief wordt in de uitzending slechts ten deel behandeld maar de integrale versie staat hier onder.

Brief van Drs. Mario Ortiz aan alle 150 Tweede Kamerleden

Geachte Kamerleden,

U heeft het giga druk, dus ik val maar met de deur in huis met zeer belangrijke informatie, welke ik in het landsbelang acht, en waar u direct wat aan heeft.

Relevante introductie kort
Ik ben moleculair geneticus, en ben dat vanuit de biochemie geworden aan de Rijksuniversiteit Leiden. Tevens inmiddels ook meer dan 20 jaar werkzaam in de farmaceutische- en medische industrie.

Foute interpretatie van positieve PCR uitslagen en onterechte en foutieve klinische extrapolatie zorgt voor grove beleidsfouten. Ik heb zelf ruime ervaring met PCR, omdat dit in mijn universitaire vorming zat als biochemicus / moleculaire genetica hoofdvak. Dus ik weet goed hoe de vork in de steel zit.

Even los van de vraag, of de aan u gerapporteerde positieve PCR test aantallen nou procentueel erg weinig voorstellen, en er in relatieve zin eigenlijk weinig aan de hand is, is er iets veel wezenlijkers, wat u echt moet weten. De GGD’s presenteren u een ‘toename’ in absolute cijfers van positieve PCR test uitslagen (helaas niet procentueel). Een positieve PCR uitslag toont louter en alleen aan, of er bij iemand (een stukje) viraal RNA in neus slijmvlies zat.

Cruciaal
Iemand bij wie de test positief is, BETEKENT NIET, dat die persoon ook daadwerkelijk klinisch is geïnfecteerd, ziek is, of ziek gaat worden. Dat kan een PCR uitslag helemaal niet aantonen. Daar is deze moleculair biologische assay niet voor. Daar heb je namelijk extra klinische parameters voor nodig, want de PCR detecteert niet eens, of er intact virus RNA aanwezig was in de persoon, noch kun je iets zeggen of het virus infectieus is, of is geweest.

Ik maak mij ernstig zorgen, omdat u momenteel mogelijk (door toedoen van de media) onterecht de indruk heeft, dat het aantal potentieel zieke mensen met corona zal gaan toenemen, maar dat is dus niet correct! U, of een van uw medewerkers, kan mij contacten voor verdere toelichting hierover. Maar u kunt dit eigenlijk aan elke klinisch biochemicus vragen.

Zelf de Proef op de som nemen
U kunt dit ook heel makkelijk zelf verifiëren. De GGD verzamelt al weken / maanden data van wie positief getest is (+ BCO). En aangezien de incubatie tijd van het virus zo ongeveer 1 week is (max 12 dagen), kunt u zowel retrospectief, alsook prospectief zo zien, of er allemaal extra zieken bij zijn gekomen, resp. bij zullen komen binnen ca. 1 week. Dat is niet het geval. En ik voorspel u, dat dit ook niet zal gebeuren. Een klein deel van echte corona zieken komt soms ook in het ziekenhuis terecht, maar zoals u gezien heeft zitten ook de ziekenhuis opnames de afgelopen maanden op een nullijn. Dus u kunt eigenlijk al zien dat daar niets additiefs gebeurd is, of gebeurt. Dus hier aan kunt u al zien, dat die positieve PCR uitslagen nergens toe leiden.

U stuurt nu uw beleid en maatregelen op basis van angst voor extra ‘besmettingen’, maar voornoemde term is dus een zeer misleidende term voor de positieve PCR test uitslagen, die niets meer betekent, dan wat (vermoedelijk oudere) RNA fragmentjes van het virusgenoom, of soms zelfs een ander verwant virus. Het gaat daarbij ook nog eens om hooguit amper 1–2 % van alle geteste personen. Helaas blijft de media de term ‘besmettingen’ maar gebruiken, maar zij realiseren zich niet wat de implicaties hiervan zijn, en weten zij niet eens wat PCR inhoudt. Ik wel. En vele vakgenoten met mij ook.

U zult begrijpen, dat ik mij daarom ernstig zorgen maak, want ik zie dat er hele verkeerde conclusies worden getrokken, die het landsbelang ernstig schaden.

Met vriendelijke groeten, Drs. Mario Ortiz, biochemicus (moleculaire genetica), Medical Advisor Farma (Integraal overgenomen van Cafe Weltschmerz)

Bestaat SARS-Cov-2 wel? Waar is het bewijs dan? Patrick Savalle en Flavio Pasquino

Comparison of commercial realtime reverse transcription PCR assays for the detection of SARS-CoV-2

Journal of Clinical Virology: 129, 104510, 2020
Zsófia Iglóia, Margareta leven, Zain Abdel-Karem Abou-Nouara, Babette Weller, Veerle Matheeussen, Jasmine Coppens, Marion Koopmans en Richard Molenkamp
Comparison of commercial realtime reverse transcription PCR assays for the detection of SARS-CoV-2

The emergence of a new coronavirus in Wuhan China has triggered a global need for accurate diagnostic assays. Initially, mostly laboratory developed molecular tests were available but shortly thereafter different commercial assays started to appear and are still increasing in number. Although independent performance evaluations are ongoing, available data is still scarce. Here we provide a direct comparison of key performance characteristics of 13 commercial RT-PCR assays. Thirteen RT-PCR assays were selected based on the criteria that they can be used following generic RNA extraction protocols, on common PCR platforms and availability. Using a 10-fold and 2- fold dilution series of a quantified SARS-CoV-2 cell-cultured virus stock, performance was assessed compared to our in house validated assay. Specificity was tested by using RNA extracted from cultured common human coronaviruses. All RT-PCR kits included in this study exhibited PCR efficiencies > 90%, except for the Sentinel Diagnostics B E-gene RUO assay (80%). Analytical sensitivity varied between 3.3 RNA copies to 330 RNA copies. Only one assay cross reacted with another human coronavirus (MERS). This study provides a technical baseline of 13 different commercial PCR assays for SARS-CoV-2 detection that can be used by laboratories interested in purchasing any of these for further full clinical validation.

A SARS-like Coronavirus was Expected, but nothing was done to be Prepared

CDC’s Diagnostic Multiplex Assay for Flu and COVID-19

CDC’s Diagnostic Multiplex Assay for Flu and COVID-19 at Public Health Laboratories and Supplies

CDC’s Diagnostic Multiplex Assay for Flu and COVID-19

Instructions for Use of CDC Influenza SARS-CoV-2 (Flu SC2) Multiplex Assay

rRT-PCR Panel Primers and Probes

2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-time rRT-PCR Panel Primers and Probes. Note: Oligonucleotide sequences are subject to future changes as the 2019-Novel Coronavirus evolves. Last Updated: May 29, 2020

rRT-PCR Panel Primers and Probes

SARS-CoV-2 Viral Culturing

Vero CCL-81 cells for isolation in-vitro

Falend PCR testbeleid: brandhaard zelf gecreëerd
Gepubliceerd op 13 oktober 2020 door drs. Mario Ortiz Martinez.

Internationale PCR deskundige en moleculair geneticus dr. Peter Borger meldt schokkende bevindingen PCR tests aan RIVM

Het aantal ‘besmettingen’ neemt de laatste tijd toe. Niet alleen in absolute aantallen door het opschalen van het testbeleid, maar ook procentueel. Steekt het corona virus weer de kop op of zijn er andere oorzaken?
Recentelijk blijken er twee essentiële zaken te zijn gewijzigd in de COVID-19 richtlijn van het RIVM. De uitleg, die het RIVM (Coen Berends) hierop heeft gegeven, hebben wij voorgelegd aan moleculair geneticus Peter Borger, tevens expert op het gebied van PCR. Hieronder deelt hij zijn schokkende reacties.

Coen Berends (RIVM): Het landschap van PCR testen voor SARS-CoV-2 heeft zich van het begin met twee in-house protocollen met één set primers en probes met twee target genen uitgebreid naar een scala aan protocollen gebaseerd op in-house ontwikkeling en in gebruik nemen van commerciële PCR testen en testen gebaseerd op andere amplificatie technieken. Die hebben allemaal hun eigen temperatuur en aantal amplificatiecycli. Die ligt voor het overgrote aantal testen tussen de 40 en 45 en is niet in de tijd verandert.
Peter Borger: Deze testen moeten ergens zijn gedocumenteerd, dan wel gepubliceerd, net als de publicatie van het RKI. Het gestandaardiseerde protocol (SOP) willen we graag inzien, zodat we de deze test kunnen reproduceren. Als er meerdere verschillende testen naast elkaar worden gebruikt, dan dienen die allemaal een eigen SOP te hebben. Deze SOPs willen we graag inzien.
De verschillende amplificatietechnieken moeten worden gespecificeerd. Er zijn momenteel 2 amplificatietechnieken in de literatuur beschreven, waarvan alleen de PCR techniek is gevalideerd. De alternatieve amplificatietechnieken moeten hier dus worden aangegeven en er moet ergens een publicatie zijn, die toont, dat die werden gevalideerd. PCR data die worden verkregen na 35 cycli zijn volstrekt onbetrouwbaar. Als het aantal amplificatiecycli inderdaad voor het overgrote aantal van de testen tussen de 40 en 45 cycli ligt, dan zijn de testen allemaal gedraaid in de achtergrondruis van het systeem. Volgens de journalist van het AD zeggen de mensen (Rotterdam of Radboud geloof ik) dat ze testen tussen 20 en 25 cycli. Dit is volstrekt oké, maar is in volkomen tegenspraak met dit bericht van het RIVM. Dit soort microbiologische diagnostische testen (SOPs) moet opgezet en gevalideerd zijn voor maximaal 35 cycli. Boven 40 cycli worden te veel monsters vals positief. Dat weten ook de mensen in Rotterdam of het Radboud in Nijmegen.

Coen Berends (RIVM): ‘Het verschil in aantal cycli maakt niet dat meer monsters positief worden of er meer foutief positieven bij zouden komen.
Peter Borger: Dit is niet correct en wordt ook niet correcter door het vet af te drukken. NB: Elke cyclus geeft een extra amplificatie met factor twee. Als je 5 extra cycli includeert, dan heb je 32x zoveel signaal. Dit gaat dan zeer zeker je positiviteit beïnvloeden. Daarom is het opstellen van een gestandaardiseerde SOP van essentieel belang. Je hebt een SOP nodig om de positieven van de negatieven te onderscheiden. Die SOP moet aangeven welke hoeveelheid uitgangsmateriaal je neemt (stel een wattip met noseswap), de Temperatuur waarden en het aantal cycli wanneer deze positief mag zijn, dat wil zeggen het maximale aantal cycli. Als dat voorheen 30 cycli waren, dan mag je dat NOOIT verhogen naar 35. Doe je dat wel, dan moet je daarvoor een goede reden hebben en je moet erbij aangeven dat de nieuwe SOP niet meer vergelijkbaar is met de vorige SOP. Doe je dat niet dan misleid je ernstig.

Coen Berends (RIVM): Het kan helpen om monsters die laat in het aantal cycli positief worden een nog duidelijkere amplificatiecurve te geven.
Peter Borger: Zo werkt het niet. Je mag niet eindeloos PCR cycli draaien. Je moet een SOP hebben die discrimineert tussen een positief en een negatief resultaat. Het RIVM protocol lijkt erop gericht om een positief resultaat te krijgen. Dit is een enorme bias die je introduceert. In de diagnostiek mag dit NOOIT. In een researchlab is dit toegestaan, maar waar het patiënten betreft niet! In de patiëntendiagnostiek werk je met SOPs, die duidelijke moeten aangeven hoe je moet discrimineren tussen negatief en positief. Daarom zei Kary Mullis, de uitvinder van de PCR technologie, dat je de PCR nooit voor microbiologische/virologische diagnostiek mag gebruiken. Doe je het wel, dan moet je een extreem goede SOP hebben! Maar blijkbaar is die er niet.

Coen Berends (RIVM): Door kwaliteitscontrole weten we dat alle PCR testen en andere amplificatietesten die nu in Nederland gebruikt worden een vergelijkbare limiet van detectie hebben.
Peter Borger: Als dat ‘laat in het aantal cycli’ is, zoals het RIVM eerder schrijft, dan is dat tussen 40 en 45 cycli. Dit is het amplificatiegebied gebied dat volstrekt onbetrouwbaar is. Als er labs zijn die > 40 cycli draaien, dan verklaart dat een heleboel. Boven 40 cycli vind je een enorme hoeveelheid valse positieven. Er dient dus meteen een SOP te worden opgesteld voor heel Nederland, waarbij het max aantal cycli wordt vastgelegd. En dat moet ver onder de 40 liggen. Ik stel voor maximaal 35 cycli te draaien. Als de test dan negatief is, dan moet de test zo worden verwerkt. Als dit niet is gebeurd, dan is de hele procedure onbetrouwbaar en geeft een grote hoeveelheid valse positieven.

Coen Berends (RIVM): Waar eerst vanwege materiaal en reagentia tekorten van twee targets overgaan is naar één target zijn door introductie van commerciële kits en betere beschikbaarheid van materialen en reagentia steeds meer tests met meerdere targets in gebruik genomen.
Peter Borger: Ja, dat er op deze manier wordt gehandeld kan ik me om economische redenen voorstellen. Er worden te veel mensen neus-swabs afgenomen en men heeft de capaciteit en het geld niet om ze goed te analyseren. En dus wordt er een compromis aangegaan. In plaats van drie genen, wordt er nog maar eentje getest. Daarmee reduceer je de betrouwbaar van de test enorm. Met drie genen heb je drie signalen en als die alle drie positief zijn, dan weet je dat je een virus te pakken hebben. Met een signaal negatief en twee positief ben je al niet meer zeker of je een virus hebt; met slechts één van de drie positief weet je niks meer. Als je het aantal signalen reduceert met factor 3 (van drie genen naar één), dan introduceer je een veel grotere informatieve onzekerheidsmarge. Immers je hebt twee positieve controles uit je experiment verwijdert. En daarom kun je niks meer met zekerheid zeggen over het ene overgebleven signaal.

Coen Berends (RIVM): Hierdoor zijn er niet meer of minder foutief positieve resultaten.
Peter Borger: Deze aanname is helaas onjuist, zoals boven uitgelegd.

Coen Berends (RIVM): Omdat verschillende targets niet 100% vergelijkbaar in sensitiviteit zijn kan het aantal zwak positieven toenemen, omdat bij zwak positieven niet altijd alle targets positief zijn.
Peter Borger: Omdat ze geen SOP hebben (lijkt het), hebben ze dus ook niet gedefinieerd wat zwak positief is. Wat is zwak positief? 30 cycli? 31 cycli? 32? Dat moet beslist gedefinieerd in een SOP. En wat betekent zwak positief op signaalniveau? Alle drie genen positief? Of twee van drie positief. Ze geven zelf al aan dat voor zwak positieven niet alle signalen (target) optreden. Voor het positief zijn van de test moeten alle targets positief zijn. Als er één positief is, zegt dat dus nog niks. Het kunnen nog steeds vals positieven zijn, omdat de andere twee signalen negatief zijn. Door nu ook nog eens de test op een target te reduceren haal je een enorme groot aantal vals positieven binnen. Als ik het zo inschat, dan is er geen algemene SOP voor de RT-PCR test, die men overal in NL zou kunnen toepassen.
Alle labs in NL werken dus naar eigen goeddunken en eigen inzichten. Dat is een uiterst dubieuze en zeer onwetenschappelijke aanpak. Als die SOPs er wel zijn, dan dienen die in heel NL hetzelfde te zijn.

Coen Berends (RIVM): Dit is normaal en het gevolg van een statistisch proces om een lage concentratie virus in een monster rond de detectie limiet van de test op te kunnen pikken.
Peter Borger: Dit is ook onjuist. Ten eerste is het geen virus, maar een RNA molecuul dat wordt geamplificeerd. Als men erop uit is om één molecuul te vinden tussen miljoenen andere moleculen, dan is er een betere methode, nl. nested PCR. Die zijn betrouwbaar. Maar het gaat er niet om maar één molecuul te vinden. Het gaat erom om de geïnfecteerden van de niet-geïnfecteerden te kunnen onderscheiden. En dan heb je een SOP nodig, die daarvoor is ontworpen.

Coen Berends (RIVM): Kortom, het aantal amplificatie cycli wat in PCR testen of ander amplificatie technieken gebruikt wordt is optimaal voor een sensitieve test.
Peter Borger: Optimaal moet hier gedefinieerd worden. Optimaal voor wat? Voor het aantonen van een molecuul? Of optimaal om te kunnen discrimineren tussen een besmette en een gezonde persoon? Het draaien van 40-45 cycli is in feite lukraak amplificeren en heeft met een diagnostische SOP niks te maken. Een specifiek signaal dat een infectie van een aspecifiek signaal kan onderscheiden ligt onder de 35 cycli. Zeker als je het met niks gaat vergelijken (let wel het RIVM gebruikt geen kwantitatieve PCR methode).

Coen Berends (RIVM): En het aantal amplificatie cycli is sinds de start van SARS-CoV-2 circulatie in Nederland niet verhoogd om meer monsters positief te vinden.
Peter Borger: Als het niet is verhoogd en steeds al bij 40-45 cycli lag, dan verklaart dat heel erg veel. Dan hebben we te maken met een over-amplificatie die geen enkele relevantie heeft m.b.t. diagnostiek van SARS-CoV-2.

Coen Berends (RIVM): Daarnaast is het gebruik van meer dan één target ingegeven om minder patiënten met een erg lage hoeveelheid virus te missen en het risico te spreiden dat ondanks zorgvuldige ontwikkeling van de testen door mutaties in het virus genoom een test op één deel van het virus genoom opeens minder gevoelig zou kunnen worden en er patiënten gemist zouden kunnen worden. Dit is tot nu toe niet opgetreden met de veel gebruikt E-gen PCR, omdat die gebruik maakt van een zeer stabiel deel van het erfelijk materiaal van het virus.
Peter Borger: Meer dan één target gebruiken we in het lab om zeker te zijn, dat we niet te maken hebben met vals positieven. Het heeft niks te maken met mutaties die zouden kunnen optreden. Als PCR deskundige raad ik af, in navolging van Kary Mullis (de uitvinder van de PCR methode), om microbiële en virologische diagnostiek met behulp van RT-PCR uit te voeren. De techniek is er niet geschikt voor, omdat ze te gevoelig is (zeker als je 40-45 cycli neemt) en daarmee te veel vals positieven geeft.

Conclusie

Als je de techniek wel wilt toepassen, zoals de virologen hebben besloten, dan moet je minstens op zekerheid spelen. Daarom heeft men initieel voor drie signalen (genen) gekozen. Als ze alle drie positief zijn, dan kun je (vrijwel) zeker zijn dat het om het virus gaat. Zijn er maar twee positief, dan zou het virus kunnen zijn, maar dat is dan minder zeker (immers maar 2/3 zijn positief).
Met maar één positief signaal heb je waarschijnlijk geen virus en moet je de test opnieuw uitvoeren, of het resultaat als negatief beoordelen. Dat is allemaal zeer bewerkelijk, kost een hoop tijd en is duur. Dus gaan ze nu over op één signaal. Dit is onverantwoord.
Zonder de extra controle signalen zullen ze veel meer valse positieven gaat opleveren, omdat je de twee ander signalen hebt weggelaten. Het verklaart de enorme stijging sinds september. Je ziet ook dat de hele procedure erop gericht is maar vooral geen cases te missen. We hebben hier te maken met een volstrekt uit de hand gelopen vetrouwen in een onbetrouwbare testmethode. De test dient erop gericht te zijn om positieven van negatieven te kunnen onderscheiden. En daarvoor dienen ze een goed werkende SOP op te zetten. Daarin moet beschreven worden:

  • Hoeveelheid uitgangsmateriaal;
  • Hoeveel en concentratie van de buffers en primers moeten gespecificeerd;
  • Temperatuur en tijdsduur per cyclus;
  • Het aantal cycli;
  • Interpretatie curves (CT helling en hoogte).

Geef een reactie

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *